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蛋白與配體能否結(jié)合、結(jié)合的強(qiáng)弱會直接影響蛋白檢測或純化實驗的成敗。此篇文章由月旭科技首席科學(xué)家王國斌博士執(zhí)筆，對蛋白結(jié)合和解離常數(shù)進(jìn)行了較為系統(tǒng)的講述。

蛋白和配體結(jié)合的強(qiáng)弱不同，對于蛋白檢測以及親和分離純化實驗有顯著影響。在設(shè)計實驗時應(yīng)考慮這種結(jié)合強(qiáng)弱影響，以便采用合適的蛋白或配體濃度（包括更低檢測限濃度），估算結(jié)合時間，獲得更佳并且實用的結(jié)果。 這對于室溫下易失去活性，或希望盡可能保持更高活性蛋白的純化尤為重要。

常規(guī)的蛋白檢測方法，比如ELISA，只能測定實驗結(jié)束時的蛋白結(jié)合數(shù)值，不能跟蹤整個過程。這不利于獲取結(jié)合的動力學(xué)數(shù)據(jù)，阻礙了實驗的優(yōu)化。自從上個世紀(jì)90年代Biacore商品化surface plasmon resonance技術(shù)后，目前已有幾種生物傳感器技術(shù)，能夠跟蹤蛋白和配基的real-time結(jié)合過程，檢測結(jié)合的全部過程，給出結(jié)合的動力學(xué)數(shù)據(jù)。下圖是我在SRU Biosystems用光學(xué)生物傳感測定蛋白A和不同濃度人類IgG隨時間變化的結(jié)合曲線。IgG濃度在100μg/mL時，結(jié)合在2-3分鐘內(nèi)迅速上升后，緩慢增加。在濃度減小時，結(jié)合速度變慢。濃度在6.25μg/mL時，結(jié)合在180分鐘內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定地增加。濃度小于1μg/mL時，結(jié)合仍然進(jìn)行，但是十分緩慢。

圖1. 10種濃度的人類IgG與光生物傳感器表面

的蛋白A結(jié)合的real-time時間曲線。

IgG濃度從100μg/mL，做1:2稀釋，

直到0.09μg/mL（90ng/mL）和0對比。

絕大多數(shù)生化實驗室，沒有real-time跟蹤檢測手段，蛋白檢測或者純化過程中，確定蛋白的濃度和結(jié)合時間通常根據(jù)結(jié)合的強(qiáng)弱來確定，而結(jié)合強(qiáng)弱是通過解離常數(shù)來判斷的。

在化學(xué)、生物化學(xué)中，解離常數(shù)（K_D) 是一種反應(yīng)的平衡常數(shù)，用于測量較大物體可逆地分離（解離）成較小成分的傾向。解離常數(shù)是結(jié)合常數(shù)的倒數(shù)。 雖然解離常數(shù)是動力學(xué)理論的參數(shù)， 但是它在生物化學(xué)，尤其實驗設(shè)計上有現(xiàn)實意義的指導(dǎo)作用。

對于一個可逆的蛋白結(jié)合過程

（1）P+L?P L

PL是蛋白P和配體L的親和產(chǎn)物。解離常數(shù)K_D定義為

（2）K_D=[P]_e[L]_e/[PL]_{_e}=1/K_A

其中[P]_e’[L]_e和[PL]_e分別是到達(dá)平衡時，P、L和結(jié)合物PL的濃度。K_A是結(jié)合常數(shù)。結(jié)合率?定義為蛋白P與配體L結(jié)合成PL的比例。

（3）?=[PL]_{_e}/[P]_t 

[P]_t是起始的蛋白P總濃度。平衡時蛋白濃度

（4）[P]_e= [P]_t-[PL]_e 

等式（2）變成

 (5) K_D=（[P]_t-[PL]_{_e}）[L]e/[PL] 

等式（5）變成

(6) [PL]_{_e}/[P]_t=[L]_e/(K_D+[L]_e)  

結(jié)合率?轉(zhuǎn)化為  

（7） ?=[PL]_{_e}/[P]_t=[L]_e/(K_D+[L]_e)

平衡時省余未結(jié)合配體濃度

（8）[L]_e=? K_D/(1-?)                         

當(dāng)?shù)鞍?/span>L有一半結(jié)合時，?=0.5

（9） [L]_e=K_D                                     

更后平衡狀態(tài)結(jié)合配體的濃度就等于解離常數(shù)。下面闡述其實用價值。

圖2. 不同配基濃度和蛋白結(jié)合率?。

K_D=1nM——；K_D=5nM——

例如K_D為1nM時，更后剩余的配基平衡濃度為1nM，一半的蛋白會與配體結(jié)合（?=0.5）。K_D為5nM時，更后剩余的配體平衡濃度為5nM時，一半的蛋白會與配體結(jié)合（?=0.5）。如果想要提高蛋白結(jié)合率到六成（?=0.6圖中紫線），就要增加配基濃度，達(dá)到更后配基平衡濃度分別為1.5nM（K_D=1nM）和7.5nM（K_D=5nM）。對于蛋白A填料來說，配體就是抗體，不同動物/總類的抗體有不同的K_D。如果給與足夠時間，結(jié)合達(dá)到平衡后（靜態(tài)載量），沒結(jié)合抗體的濃度也不同。K_D小，會有更高的靜態(tài)載量，分離得更完全。 要想提高低K_D抗體的載量，只能提高填料表面蛋白A的密度。如果時間短，沒有達(dá)到更后的結(jié)合平衡，現(xiàn)實的例子就是抗體流過蛋白A填料柱。在相同時間里，K_D小的，會有更多的抗體與蛋白A結(jié)合。對于同樣的K_D流速低，時間長，動態(tài)載量也會更高。

反之， 在更后配體平衡濃度為8nM（圖中紅線）時，K_D?。?/span>1nM）的蛋白結(jié)合率能達(dá)到0.89，而K_D大（5nM）的蛋白結(jié)合率只有0.62。 這對于無蛋白檢測時，試劑濃度選定有幫助。比如ELISA的二抗（檢測抗體）或者熒光標(biāo)記的二抗以及鏈霉親和素（Streptavidin）濃度確定后，K_D對蛋白（被檢測物）的濃度測定的影響就顯而易見。K_D小的被檢測蛋白，比如蛋白A或者蛋白A的填料，結(jié)合率高，檢測結(jié)果更準(zhǔn)確。如果K_D較大，就要提高二抗?jié)舛?，以確保檢測數(shù)據(jù)可信度，或者縮短實驗周期。

圖3. 蛋白結(jié)合強(qiáng)弱劃分定義

在分子生物學(xué)上，K_D<10^-8M (10nM或者0.01μM)屬于強(qiáng)結(jié)合； 10^-4M>K_D>10^-8M屬于中等結(jié)合；K_D>10^-4M (0.1mM)屬于弱結(jié)合。蛋白A與不同種類抗體結(jié)合的強(qiáng)弱不同。例如protein A與人類IgG1、IgG2和IgG4的K_D約為2×10^?9M，屬于強(qiáng)結(jié)合。下表列出不同抗體與蛋白A結(jié)合的強(qiáng)弱情況。蛋白檢測，分離純化過程中，應(yīng)該參照結(jié)合強(qiáng)弱，設(shè)計操作方案。

鏈霉親和素（streptavidin）是生物化學(xué)常用的試劑。它于生物素（biotin）結(jié)合的K_D非常小，僅為~10^?14M。 強(qiáng)度與共價鍵類似。前文介紹過，鏈霉親和素是非常穩(wěn)定50K_D蛋白，經(jīng)常用來與熒光、紅外、ELISA標(biāo)記等化學(xué)結(jié)合而不失去其生物活性。生物素是分子量244，帶有羧基的小分子。 容易與蛋白化學(xué)結(jié)合。這樣帶有標(biāo)記的鏈霉親和素，與帶有生物素的蛋白結(jié)合，從而避免直接標(biāo)記蛋白。鏈霉親和素和生物素K_D小。對比于直接標(biāo)記二抗的方法，采用標(biāo)記的鏈霉親和素-生物素的方法用量小、時間短，達(dá)到準(zhǔn)確檢測的目的。基于這種原因，標(biāo)記的鏈霉親和素、化學(xué)活化的生物素以及生物素結(jié)合的二抗等蛋白檢測試劑，比較容易購買，這對于實驗方案設(shè)計非常便利。

作者?

王國斌，美籍華人博士，在生命科學(xué)和表面化學(xué)領(lǐng)域有著20多年的產(chǎn)品研發(fā)經(jīng)驗。擁有反相表面聚合技術(shù)等多項發(fā)明專利，并有GRAFT-COAT?涂層技術(shù)和蛋白質(zhì)的HydroGel?涂層載玻片等多款專利產(chǎn)品面世。曾就職于多家醫(yī)療器材和生物科技公司，包括Perkin Elmer和SRU Biosystems，參與開發(fā)了 BIND?生物傳感器。

王國斌博士憑借在高分子化學(xué)、表面科學(xué)、蛋白質(zhì)兼容表面等方面的豐富經(jīng)驗，在加入月旭科技后，主持研制了“續(xù)凈一號”銀離子消毒液，并對月旭科技的蛋白純化系列產(chǎn)品的研發(fā)提供了ji大的技術(shù)支持。為今后月旭科技在生命科學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展注入一劑強(qiáng)心針。